新しいがんイメージングDIIFCO法の開発～がん微小環境を三次元レベルで解析可能に～　田中伸之、大家基嗣（泌尿器科）

研究の背景

生体内でがんを取り巻く環境は、がんの成長に不可欠な栄養供給を支える血管や炎症細胞の浸潤に加えて、がん自身に起こる上皮間葉転換で、絶え間なく変化し続けています。上皮間葉転換とは、上皮細胞に由来するがん細胞がその特徴を変化させ、間葉系様の細胞に形態変化する現象です。この上皮間葉転換を介して、がん細胞は進行・転移します。

このようながんを取り巻く環境は「がん微小環境」と呼ばれ、抗がん治療に対する耐性化の原因とも考えられています。これを正確に理解することは、がん根絶を試みる基礎研究者にとって重要な課題です。さらにがん治療に従事する臨床医にとっては、治療予測を可能とするバイオマーカーにつながる可能性があります。

これまで、がん微小環境をミクロなレベルで可視化するための様々な顕微鏡や画像技術が開発されてきました。従来の顕微鏡では、得られた腫瘍組織を薄く切片に（2次元化）することで、タンパクおよび遺伝子の発現解析を行っていました。しかし、これでは組織断面を描画するだけの2次元イメージングに留まり、がん微小環境における3次元腫瘍情報の詳細を得ることができません。また、がん微小環境の分子機構をより正確に理解するために、病理学的な免疫組織染色法によるタンパクの局在解析に加えて 、分子生物学的なin situハイブリダイゼーション法によるRNAの局在解析も重要になっています。タンパクまで翻訳される遺伝子は、全遺伝子の1.5％に満たず、多くの発現遺伝子は細胞内にRNAとして存在し、癌微小環境の制御を行います。in situハイブリダイゼーション法は特異的なプローブを用いることで、RNAを検出する研究手法です。

しかし、in situハイブリダイゼーション法を施行するためには、RNAを包むタンパクを試薬で分解し、RNAを露出させる必要があります。この操作では、免疫組織染色とin situハイブリダイゼーション法の共存が難しいため、立体的な組織構造の維持が不可欠な3次元イメージング法を利用した1細胞レベルでのRNAとタンパクの同時解析を実現した研究はこれまでありませんでした。

研究の概要

本研究グループは、3次元ライトシート顕微鏡と組織透明化法と組み合わせることで、立体的な腫瘍空間に広がるタンパク／RNA発現の空間分布を1細胞レベルで解析可能にする、新規がんイメージングDIIFCO （Diagnosing In situ and Immuno-Fluorescence- labelled Cleared Onco-samples）法を開発しました（図1）。ライトシート顕微鏡とは、サンプルの側面からシート状の励起光を照射することで、光学断面像を得る次世代の蛍光顕微鏡です。深くまで照射できるシート状の励起光と光路を分けた検出レンズは、3次元像を得るために適しています。また、サンプルは溶媒の屈折率と一致することで透明になります。DIIFCO法では、組織を脱水・脱脂処理することで組織中の屈折率を均一化し、透明化処理を施します。今回、研究グループは、ライトシート顕微鏡に独自の免疫組織染色・in situハイブリダイゼーション法と組織透明化法を組み合わせ、標的分子のタンパクおよびRNAを発現する細胞を同時に検出し、がん組織の立体的な空間上に描画する世界初のがんイメージング法を確立しました。

図1. DIFFCO法の概略

DIIFCO法で採用される新しいin situハイブリダイゼーション法では、RNAの検出にタンパク分解の必要性がなく、DIIFCO法で透明化される腫瘍塊では、免疫組織染色とin situハイブリダイゼーション法を同時に施行することができます。ライトシート顕微鏡を用いることで、組織塊の表面から深部まで解析範囲が広がり、標的分子の発現レベルに応じる3次元腫瘍マップが作成されます。がん微小環境の解析では、免疫染色される腫瘍血管と標的分子のRNAを持つ数百～数千万のがん細胞との位置関係が1細胞ごとに可視化され、不均一な脈管構造や上皮間葉転換の空間分布、さらには血管からの距離が、ミクロなレベルで可視化されます。このため、腫瘍空間でがん幹細胞が自らを育む環境（がん幹細胞ニッチ）も世界で初めて明らかになりました（図2）。ビデオは免疫染色で抽出された腫瘍血管（白色・線状）と癌幹細胞マーカーであるCD133陽性細胞（球）の位置関係が3次元で可視化されており、血管からの距離でCD133陽性細胞（球）が色分けされています。

図2. DIFFCO法で明らかとなった細胞ニッチの詳細

図3. 癌幹細胞が生息する細胞ニッチの立体構造
＊図1~3は参考文献のFigure 4Bより転載（一部改変）

　　

本手法では、ホルマリン・パラフィン固定された保存サンプルを利用することが出来ます。つまり、DIIFCO法では病理診断後の組織やバイオバンクに存在する保存組織でも、1細胞レベルの高解像度なタンパク／RNAの同時発現解析を行うことが可能です。保存サンプルを活用できるDIIFCO法は、「ライトシート顕微鏡と組織透明化法の融合」を迅速化し、臨床現場への橋渡しを可能にする新規がんイメージングとして、将来の臨床応用が期待されます。

参考文献

Three-dimensional single-cell imaging for the analysis of RNA and protein expression in intact tumour biopsies.
Tanaka N, Kanatani S, Kaczynska D, Fukumoto K, Louhivuori L, Mizutani T, Kopper O, Kronqvist P, Robertson S, Lindh C, Kis L, Pronk R, Niwa N, Matsumoto K, Oya M, Miyakawa A, Falk A, Hartman J, Sahlgren C, Clevers H, Uhlén P.
Nature Biomedical Engineering 2020; 4: 875-888.

左より：筆頭著者の田中伸之（慶應義塾大学医学部泌尿器科学教室助教）、責任著者のPer Uhlén (スウエーデン、カロリンスカ研究所教授)

最終更新日：2020年11月2日
記事作成日：2020年11月2日

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  • 脳梗塞における神経症状回復を促す新規免疫細胞の発見　伊藤美菜子、吉村昭彦(微生物学・免疫学)
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  • 10億個のヒトiPS細胞由来の心室筋細胞を一度に作製する方法の開発
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    大久保光修、平橋淳一（総合診療教育センター）
  • iPS細胞を用いた胎児の形態異常の解明
    奥野博庸（生理学）
  • 紫光（バイオレットライト）の成人強度近視に対する近視進行抑制の可能性
    鳥居秀成、根岸一乃（眼科）
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    本田賢也、新幸二（微生物学・免疫学）
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    宮本健史（整形外科）
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• 2017年
  • HDLコレステロールが低い日本人の冠動脈疾患死亡リスク
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  • 脳梗塞後の炎症が収まる仕組みの解明と治療への応用
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  • 高脂血症治療薬が急性腎障害を軽減するメカニズム
    吉田 理（血液浄化・透析センター）
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  • 生殖細胞のゲノムを守る小さなRNA分子
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    湯浅慎介（循環器内科）
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  • ドライアイの病態解明をめざして―臨床と基礎研究をつなぐ―
    小川 葉子（眼科）
  • 長島型掌蹠角化症－疾患の発見から原因遺伝子の解明へ－
    久保 亮治（皮膚科）
  • 心電図から突然死のリスクを探る
    相澤 義泰（循環器内科）
  • 記憶・学習のメカニズムを分子レベルで明らかに―記憶・学習を操作できるか
    幸田 和久（生理学）
  • 脳梗塞を悪化させる炎症の仕組みを解明
    七田 崇（微生物学・免疫学）
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    赤松和土（生理学）
  • 難聴に対する、薬剤を用いた内耳有毛細胞の再生医療
    藤岡 正人（耳鼻咽喉科）
  • 脳・脊髄のガン（グリオブラストーマ）に対する新たな分子標的治療戦略
    岩波　明生（整形外科）
  • がん幹細胞におけるCD44vを介した治療抵抗性の獲得メカニズム
    永野　修（先端医科学研究所）
  • ヒトES・iPS細胞からつくった心筋細胞で心臓病を治すには？
    遠山周吾（循環器内科）
  • 造血幹細胞を老化から守る代謝制御メカニズム
    田久保 圭誉（発生・分子生物学）
  • 重症喘息に効く新しい薬を創る！　－オメガ3脂肪酸の抗炎症作用－
    宮田 純（呼吸器内科）
  • 血漿アミノ酸プロファイルを用いたIBDバイオマーカーの確立
    久松理一（消化器内科）
  • がん血管のみではたらく血管増殖メカニズム
    久保田義顕（総合医科学研究センター）
• 2012年
  • 骨は"ストレス"によって成熟する？
    堀内 圭輔（整形外科・総合医科学研究センター）
  • 毛の新たなる存在意義　－毛嚢は免疫スイッチ－
    永尾 圭介（皮膚科）
  • 心筋梗塞の傷跡をよくする白血球・悪くする白血球・調節する白血球
    安西 淳（循環器内科）
  • ビタミンEは骨を減らす？
    竹田 秀（腎臓・内分泌・代謝内科）