ヒト多能性幹細胞から高効率に骨格筋を分化させる方法　秋山智彦、洪実（坂口光洋記念講座（システム医学））

研究の背景

ヒト多能性幹細胞(注1)である胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、私たちの体を構成する様々な細胞に分化可能であり、再生医療や新薬の開発研究への応用が期待されています。しかし、ES/iPS細胞の分化誘導法は培養条件が複雑な上に、胚様体や前駆細胞を経由させ段階的に細胞を分化させるため、1) 比較的長期間の培養期間を要する、2) 分化誘導効率が十分ではない、3) 異なる細胞系譜の細胞が混在する、など問題がありました。そこで我々は、ES/iPS細胞内の遺伝子発現状態を人工的に操作することによって、目的の細胞を効率よく、かつ迅速に作り出すための新たな方法を検討してきました。細胞に発現する遺伝子の種類は、特定の転写因子(注2)のセットによって規定されています。転写因子は遺伝子発現を直接的に制御する因子であり、プロモーターやエンハンサーといった転写を制御する領域に結合することで、DNAの遺伝情報をRNAに転写する過程を促進、あるいは抑制し、細胞特異的な遺伝子発現パターンを構築します。この原理に基づき、分化に関わる遺伝子群の働きをオンにする転写因子を人工的にES/iPS細胞へ導入させれば、自在な分化誘導が可能であると期待されています。

しかしながら、ES/iPS細胞には、高い未分化性を維持する機構が存在し、分化に関わる転写因子を導入しても、迅速な分化が行われないという問題点がありました。事実、比較的分化誘導を起こしやすい線維芽細胞を骨格筋細胞へと形質転換させるマスター転写因子MYOD1の導入による分化誘導にすら、ES/iPS細胞は高い抵抗性を示します。今回、我々はES/iPS細胞が分化誘導に示す抵抗性の原因の１つを解明し、この知見をもとに転写因子を用いた分化誘導法を改良し、ES/iPS細胞から骨格筋細胞を効率よく分化誘導させることに成功しました。

研究の概要

近年、転写因子をコードする合成RNA（注3）を試験管内で作製し、ES/iPS細胞に導入する方法が開発され、ゲノム改変を伴わない簡便かつ安全な分化誘導系として広く普及しつつあります。そこで我々は、同様の方法によって筋細胞分化のマスター転写因子であるMYOD1の合成RNAをES/iPS細胞に導入し分化誘導されるのか検証しましたが、ほとんどの細胞は未分化状態を維持したままでした。分化誘導を阻害する遺伝子を特定するため、免疫染色法によりMYOD1の導入された細胞に存在する複数の未分化関連因子の発現を調べた結果、未分化性を担う遺伝子POU5F1(OCT3/4)（以下、POU5F1）が残存していることが分かりました（図1）。また、POU5F1があるとMYOD1が遺伝子を制御するゲノム領域に結合できないことも明らかとなり、この分子がMYOD1の働きを妨げている可能性が考えられました。

図1．MYOD1の合成RNAを導入した多能性幹細胞
MYOD1を導入してもPOU5F1が残存しているためMYOD１は機能することができない。

そこでPOU5F1を選択的に抑制するsiRNAと MYOD1の合成RNAを合わせたカクテル（細胞分化RNAカクテル）を作成し、ES/iPS細胞に添加したところ、分化誘導開始から5日目に80%の細胞が骨格筋マーカーであるMyHCを発現していました。また、この細胞はサルコメア構造や融合能を有する機能的な骨格筋細胞であることが分かりました。従来のMYOD1の合成RNAを単独で導入する手法ではMyHC発現を指標にした分化効率が6%であったことから、今回の手法は、機能的な骨格筋細胞の生産性の効率を大きく向上させたといえます（図2）。

さらに網羅的な遺伝子発現解析を行った結果、POU5F1の抑制は骨格筋細胞分化に必須な成長因子の発現を促していることを発見しました。このことから、POU5F1の抑制はES/iPS細胞の未分化性を解除するだけでなく、多元的に分化誘導をサポートすることが示唆されました。

図2. 骨格筋細胞を示す免疫染色像
MYOD1の合成RNAを添加してもES細胞やiPS細胞から骨格筋細胞（緑）はほとんどできないが、POUSF1を抑制するRNA（siPOUSF1）を同時に添加すると分化効率が上昇する。

今後の展望

「細胞分化RNAカクテル」を用いて、骨格筋細胞へと分化誘導した場合、複数のES/iPS細胞株で効率よく、短期間で骨格筋細胞を得ることができます。今回の結果は、骨格筋細胞の基礎研究のみならず、骨格筋の異常で起こる筋ジストロフィーなど様々な病気の病態解明、治療薬の開発などに役立つことが期待されます。さらに、POU5F1の抑制は、ES/iPS細胞の未分化性を解除するため、骨格筋細胞だけでなく、ほかの細胞系譜への分化誘導にも応用可能であると考えられます。ES/iPS細胞にMYOD1以外の転写因子を用いたRNAカクテルを導入すれば、これまで分化誘導が困難であった組織や器官の細胞を高効率に作製できることが期待されます。

【用語解説】

(注1) ヒト多能性幹細胞
発生初期の細胞のように、体を構成するさまざまな細胞に分化する能力を持つ培養細胞 で、胚盤胞に由来する胚性幹細胞（ES 細胞）と体細胞に 由来する人工多能性幹細胞（iPS 細胞）がある。

(注2) 転写因子
DNA に結合するタンパク質で特定の遺伝子発現レベルを調節する。

(注3) 合成 RNA
遺伝子 DNA を型枠に見立てて、試験管の中で合成される。細胞の中に 導入されると自 然に存在する mRNAと同じように、タンパク質の合成が行われる。

参考文献

Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into skeletal muscle cells by combining RNA-based MYOD1-expression and POU5F1-silencing.
Akiyama T, Sato S, Chikazawa-Nohtomi N, Soma A, Kimura H, Wakabayashi S, Ko SBH, Ko MSH.
Sci Rep. 2018 Jan 19;8(1):1189. doi: 10.1038/s41598-017-19114-y.

左から、秋山智彦（坂口光洋記念講座（システム医学）助教）、洪実（同教授）

最終更新日：2019年1月7日
記事作成日：2019年1月7日

▲ページトップへ

慶應発サイエンス

• 2024年
  • 多発神経鞘腫を有する神経線維腫症2型（NF2）に対する初の免疫療法（臨床試験報告）　田村亮太、戸田正博（脳神経外科）
  • CAR-T細胞療法の効果と安全性を高める人工サイトカイン受容体　籠谷勇紀（先端医科学研究所がん免疫研究部門）
  • 医師と患者さんのコミュニケーションギャップを埋める患者報告アウトカムの活用を　～より患者さんのニーズに沿った治療の提案が可能に～　池村修寛、香坂俊（循環器内科）
  • 化学治療抵抗性乳がん細胞の代謝特性　山本雄広（医化学教室）、林田哲（一般・消化器外科）、末松誠（慶應義塾大学名誉教授）
  • 網羅的なゲノム解析で成人女性の冷え症と関連する遺伝要因を発見　吉野鉄大（漢方医学センター）
  • 汗の乳酸を測定するバイオセンサの低酸素トレーニングでの活用　勝俣良紀、岩澤佑治（スポーツ医学総合センター）　大川原洋樹（整形外科）　中島大輔（整形外科、久光製薬運動器生体工学寄付研究講座）
  • 無症候性のSARS-CoV-2ワクチン接種者と非接種者における心筋18（¹⁸F）fluorodeoxyglucose（FDG）集積の比較　中原健裕、岩渕雄、冨田快、志賀哲、陣崎雅弘（放射線診断科）
  • 精神科診療におけるオンライン診療は対面診療と同等の治療効果であることを国内19機関が参加した非劣性試験で証明　木下翔太郎、岸本泰士郎（ヒルズ未来予防医療・ウェルネス共同研究講座）
  • 骨の端にある特殊な血管構造を発見　久保田義顕（解剖学教室）
  • ジスキネジア（体のクネクネ、口のモゴモゴ）はなぜ起こる？ 阿部欣史、田中謙二（先端医科学研究所・脳科学研究部門）竹内啓善（精神・神経科）
  • 原発性硬化性胆管炎に対するバクテリオファージを用いた新規治療の可能性　市川将隆、中本伸宏、金井隆典（消化器内科）
• 2023年
  • 心臓由来コラーゲンによるヒト人工心筋組織の成熟化　谷英典（循環器内科、心臓病未来治療学共同研究講座）小林英司、遠山周吾（循環器内科）
  • iPS細胞はそのヒトを映す「鏡」―筋萎縮性側索硬化症（ALS）の克服に向けて―　森本悟、岡野栄之（生理学教室）
  • 関節リウマチにおける生物学的製剤開始時のメトトレキサート減量試験　玉井博也、金子祐子（リウマチ・膠原病内科）
  • アミノ酸の左右のバランスを決める仕組みを解明　権田裕亮、笹部潤平（薬理学教室）
  • 頸動脈小体腫瘍の原因遺伝子の特徴と発症の仕組みを解明　吉浜圭祐、小澤宏之（耳鼻咽喉科）
  • コロナ制圧タスクフォースによるCOVID-19重症化遺伝子DOCK2の同定と機能解析　南宮湖（感染症学教室）、中鉢正太郎（呼吸器内科）
  • 社交不安症のある自閉スペクトラム症者への人型ロボット介入は社交不安の軽減や発話への自信につながることが示唆された　吉田篤史（精神・神経科）
  • 未知の脳領域「前障」の形成過程を解明　大島鴻太、仲嶋一範（解剖学教室）
  • 非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）における肝細胞がん発生リスク診断法の開発　藏本純子、新井恵吏、金井弥栄（病理学教室）
  • 近視進行メカニズムの分子細胞生物学的理解の進歩　栗原俊英（眼科）
  • single cell RNA-seqデータの普遍的な特徴を抽出することに成功　－疾患解析データの本質を捉えることが可能に－　岡野雄士（医学部5年）、加瀬義高、岡野栄之（生理学教室）
  • アミロイドPET検査とタウPET検査の併用により認知症診療の診断、治療が大きく改善する可能性　伊東大介（生理学教室）
• 2022年
  • 「オメガ3脂肪酸」由来代謝物が難病肺高血圧症の病態を調節する機構を解明　守山英則、遠藤仁（循環器内科）
  • 大腸の慢性炎症（潰瘍性大腸炎）に対するこれまでにない治療機序の解明に成功　筋野智久（内視鏡センター）
  • 治療抵抗性統合失調症の興奮抑制バランスの異常とニューロモデュレーションを用いた新規治療法の開発　和田真孝（精神・神経科）
  • 大腸がんに対する薬の効果を予測するオルガノイド培養技術を開発　〜正常な「ミニ臓器」の培養効率を飛躍的に改善〜　高野愛、佐藤俊朗（坂口光洋記念講座（オルガノイド医学））
  • 乳がん治療中のQOL維持のため症状把握にLINEを活用　林田哲、北川雄光（一般・消化器外科）
  • 血管により硬い歯がつくられる仕組みを解明　久保田義顕（解剖学教室）
  • 原因不明の重症新生児に対する迅速な網羅的遺伝子解析　武内俊樹（小児科）
  • ヒトサイズに近いバイオ人工肝臓を使った移植実験に世界で初めて成功　～臓器再生医療の実現化を加速～
    八木洋、北川雄光（一般・消化器外科）
  • 成人T細胞白血病リンパ腫のゲノム異常の全体像を解明
    木暮泰寛、片岡圭亮（血液内科）
  • 免疫機能がコレステロール調節機構を利用し炎症を収束させる仕組みを解明　 高橋勇人、天谷雅行（皮膚科）
  • 疲弊したCAR-T細胞を若返らせ、強い抗腫瘍効果をもつCAR-T細胞の作製に成功　安藤眞、吉村昭彦（微生物学免疫学教室）
• 2021年
  • 新生児線状IgA水疱性皮膚症　～発生メカニズムの解明～
    江上将平、山上淳、天谷雅行（皮膚科）
  • 大腸に小腸の機能をもたせる細胞移植技術を開発　
    杉本真也、佐藤俊朗（坂口光洋記念講座（オルガノイド医学））、小林英司（循環器内科）
  • さまざまな動物種から高品質のiPS細胞を作製することに成功
    吉松祥、岡野栄之（生理学教室）
  • 免疫の暴走を開始時に防ぐ仕組みを解明
    竹馬俊介、吉村昭彦（微生物学免疫学教室）
  • 光照射とゲノム編集で妊娠をピンポイントに調節することに成功
    丸山哲夫（産婦人科）
  • 毎日1時間の水素吸入が自律神経のバランスを整え、降圧効果を発揮　多村知剛（救急科）、佐野元昭（循環器内科）、小林英司（ブリヂストン臓器再生医学寄附講座）
  • 血管とリンパ管の独立性が維持される仕組みを解明　久保田義顕（解剖学教室）
  • 潰瘍性大腸炎治療薬の青黛が肺高血圧症を起こすメカニズムを解明
    平出貴裕、片岡雅晴、福田恵一(循環器内科)、寺谷俊昭、金井隆典(消化器内科)
  • 新たな糖尿病治療薬の効果を現場で検証する～SGLT2阻害薬に関する多国籍共同解析～　香坂俊（循環器内科）
• 2020年
  • 心血管病のバイオマーカーと血漿アルブミンが究極の長寿と関連 ～スーパーセンチナリアンの生物学的特徴～
    新井康通、岡野栄之（百寿総合研究センター）
  • 新しいがんイメージングDIIFCO法の開発～がん微小環境を三次元レベルで解析可能に～
    田中伸之、大家基嗣（泌尿器科）
  • オラネキシジンによる消毒で⼿術部位感染を半減
    竹内優志、尾原秀明（一般・消化器外科）
  • 精神神経疾患の関連分子が神経細胞を正しく配置させるしくみを発見
    廣田ゆき、仲嶋一範（解剖学教室）
  • シェーグレン症候群の唾液腺における自己抗体産生
    竹下勝（リウマチ・膠原病内科）
  • 肺動脈の発生を染めて先天性心疾患の病態を探る
    石崎怜奈、内田敬子、山岸敬幸（小児科）
  • 不安症患者さんに対してマインドフルネスの効果が示されました　二宮朗（精神・神経科）
  • 尿酸降下薬による腎保護メカニズムの解明
    ～質量分析イメージングによる腎代謝解析～
    　 藤井健太郎、宮下和季（腎臓・内分泌・代謝内科）
  • 汗孔角化症の発症メカニズムを解明
    〜日本人の400人に1人が発症素因を持つことが明らかに〜　　久保亮治（皮膚科）
• 2019年
  • 心停止患者から提供された臓器を水素ガスによって移植可能な臓器へと蘇生させる新たな技術の開発に成功
    佐野元昭、小林英司（水素ガス治療開発センター）　
  • 肝臓の炎症を抑制する免疫細胞を発見～急性肝不全に対する新たな治療法の開発に期待～
    幸田裕造、中本伸宏、金井隆典（消化器内科）
  • 関節リウマチの病態に関わるT細胞の詳細解析
    竹下勝（リウマチ・膠原病内科）
  • 加齢に伴う神経新生の低下機構を解明
    ～老化による脳萎縮を部分的に防ぐことに成功～
    加瀬義高、岡野栄之（生理学）
  • 根気を生み出す脳内メカニズムの発見
    ～粘り強さは海馬とセロトニンが制御する～
    吉田慶多朗、田中謙二（精神・神経科）
  • ケトン体(β-ヒドロキシ酪酸)による腎保護作用のメカニズム
    田島敬也、脇野修、伊藤裕 (腎臓・内分泌・代謝内科)
  • 心電図からカテーテル治療の要否を判断するAIの開発
    後藤信一、佐野元昭（循環器内科）
  • 「豊かな環境」によるドライアイ予防・改善の可能性　佐野こころ（眼科学）
  • ヒト上皮幹細胞の新規培養技術の開発
    藤井正幸、佐藤俊朗
    （坂口光洋記念講座(オルガノイド医学)）
  • 新しい分子イメージング法による高血圧症の原因解明
    杉浦悠毅、西本紘嗣郎（医化学）
  • 脳梗塞における神経症状回復を促す新規免疫細胞の発見　伊藤美菜子、吉村昭彦(微生物学・免疫学)
  • 顕微鏡で観察するがん免疫の世界とその分類　紅林泰、坂元亨宇（病理学）
  • 記憶・学習のしくみを理解し、操作するための新しい技術
    掛川渉（生理学）
  • ヒト多能性幹細胞から高効率に骨格筋を分化させる方法
    秋山智彦、洪実（坂口光洋記念講座（システム医学））
• 2018年
  • 抗菌薬の隠された作用のメカニズムの解明～薬剤耐性対策につながる成果～
    南宮湖、石井誠（呼吸器内科）
  • iPS細胞技術を用いた筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態解析と創薬研究
    藤森康希、岡野栄之（生理学）
  • 10億個のヒトiPS細胞由来の心室筋細胞を一度に作製する方法の開発
    遠山周吾、藤田淳 (循環器内科)
  • 横紋筋融解症に続発する腎不全の新たなメカニズムの解明
    大久保光修、平橋淳一（総合診療教育センター）
  • iPS細胞を用いた胎児の形態異常の解明
    奥野博庸（生理学）
  • 紫光（バイオレットライト）の成人強度近視に対する近視進行抑制の可能性
    鳥居秀成、根岸一乃（眼科）
  • 口腔には腸管に定着すると免疫を活性化する細菌がいる
    本田賢也、新幸二（微生物学・免疫学）
  • 新しい遺伝子発現システムによる心筋細胞の誘導と心臓再生への応用
    梅井智彦、家田真樹（循環器内科）
  • 広汎性子宮頸部摘出術後妊娠における残存頸管長と早産リスクの関連は？
    宮越敬（産婦人科）
  • リン代謝を制御するものは老化を制御する
    宮本健史（整形外科）
  • DNAメチル化解析による脊髄移植後の腫瘍化の原因解明
    飯田剛（整形外科）
• 2017年
  • HDLコレステロールが低い日本人の冠動脈疾患死亡リスク
    平田 匠（百寿総合研究センター）
  • 細胞周期の異常はがんの進展にとって敵にも味方にもなる
    石澤丈（先端医科学研究所）
  • 脳梗塞後の炎症が収まる仕組みの解明と治療への応用
    七田 崇、吉村 昭彦（微生物学・免疫学）
  • 腹外側線条体の神経細胞が意欲の維持に関わる
    滝上紘之（生理学、精神・神経科）
  • 非小細胞肺がんで使用される分子標的薬の耐性化メカニズムの解明
    額賀重成（呼吸器内科）
  • 内耳性難聴に対するiPS創薬研究－新規病態の発見と治療薬の同定－
    藤岡 正人、細谷 誠（耳鼻咽喉科）　
  • 食べ過ぎが糖尿病や心血管疾患の発症を起こすメカニズムを解明
    白川公亮（循環器内科）
  • バルプロ酸への胎内曝露が胎児の大脳皮質形成を障害する
    藤村公乃（小児科）
  • 血液を作る幹細胞がストレスを受けて増殖する仕組みを発見
    雁金大樹（血液内科）
  • 間葉系幹細胞の免疫性線維化における役割
    小川葉子（眼科）、森川暁（歯科・口腔外科）
  • 肥満に伴う大腸マクロファージによる炎症が糖尿病発症につながる
    川野義長（腎臓・内分泌・代謝内科）
  • 眼球内の不要となった血管を退縮させる仕組み
    久保田義顕（機能形態学）
• 2016年
  • iPS細胞を高品質かつ高効率に作製する方法の開発
    國富晃（循環器内科）
  • MIRAGE症候群の発見
    鳴海 覚志、長谷川奉延（小児科）
  • 日本における認知症の社会的コスト
    佐渡充洋（精神・神経科）
  • 神経細胞の興奮の起こりやすさを制御する新しいメカニズムを解明
    松田恵子（生理学）
  • 新規筋萎縮性側索硬化症（ALS）モデルマウスの樹立に成功
    椎橋 元（神経内科）
  • 脳や脊髄の「ミエリン」をMRIで可視化する新技術
    中原 仁（神経内科）
  • 椎間板変性に対する新規治療薬の開発
    藤田順之（整形外科）
  • 乳酸アシドーシスの新規治療法の開発
    南嶋洋司（医化学）
  • 本来の位置にたどり着けない神経細胞が及ぼす脳への影響
    久保健一郎（解剖学）
  • 百寿者から探る健康長寿の秘訣
    新井康通（百寿総合研究センター）
  • iPS細胞から神経細胞を作り分ける新技術
    今泉研人（医学部5年）
  • 腸管免疫の恒常性における腸内細菌の役割
    柏木一公（微生物学・免疫学）
• 2015年
  • 高脂血症治療薬が急性腎障害を軽減するメカニズム
    吉田 理（血液浄化・透析センター）
  • 子宮の幹細胞と再生医学
    丸山哲夫（産科）
  • 生殖細胞のゲノムを守る小さなRNA分子
    齋藤 都暁（分子生物学）
  • 神経の働きを調節する新たなメカニズムを発見
    鈴木 将貴（解剖学）
  • 筋ジストロフィーに対する筋肉再生療法の開発
    湯浅慎介（循環器内科）
  • 閉経後骨粗鬆症を発症させる因子の同定に成功
    宮本健史（整形外科）
  • 筋萎縮性側策硬化症―新たな病態の解明―
    山川眞以（医学部5年）、伊東大介（神経内科）
  • 生体内ガス分子が介するがん細胞の代謝制御機構
    山本雄広（医化学）
  • 肥大型心筋症を悪化させる因子の同定に成功
    田中敦史（循環器内科）
• 2014年
  • がん間質を抑制するTIMP分子－新たながん治療戦略への期待－
    下田 将之（病理学）
  • ドライアイの病態解明をめざして―臨床と基礎研究をつなぐ―
    小川 葉子（眼科）
  • 長島型掌蹠角化症－疾患の発見から原因遺伝子の解明へ－
    久保 亮治（皮膚科）
  • 心電図から突然死のリスクを探る
    相澤 義泰（循環器内科）
  • 記憶・学習のメカニズムを分子レベルで明らかに―記憶・学習を操作できるか
    幸田 和久（生理学）
  • 脳梗塞を悪化させる炎症の仕組みを解明
    七田 崇（微生物学・免疫学）
  • 再生医学でヒトの細胞から毛をつくる
    大山 学（皮膚科）
• 2013年
  • 尿細管－糸球体連関：糖尿病性腎症の新しい発症メカニズムの解明
    長谷川一宏（腎臓・内分泌・代謝内科）
  • 神経幹細胞を作る
    赤松和土（生理学）
  • 難聴に対する、薬剤を用いた内耳有毛細胞の再生医療
    藤岡 正人（耳鼻咽喉科）
  • 脳・脊髄のガン（グリオブラストーマ）に対する新たな分子標的治療戦略
    岩波　明生（整形外科）
  • がん幹細胞におけるCD44vを介した治療抵抗性の獲得メカニズム
    永野　修（先端医科学研究所）
  • ヒトES・iPS細胞からつくった心筋細胞で心臓病を治すには？
    遠山周吾（循環器内科）
  • 造血幹細胞を老化から守る代謝制御メカニズム
    田久保 圭誉（発生・分子生物学）
  • 重症喘息に効く新しい薬を創る！　－オメガ3脂肪酸の抗炎症作用－
    宮田 純（呼吸器内科）
  • 血漿アミノ酸プロファイルを用いたIBDバイオマーカーの確立
    久松理一（消化器内科）
  • がん血管のみではたらく血管増殖メカニズム
    久保田義顕（総合医科学研究センター）
• 2012年
  • 骨は"ストレス"によって成熟する？
    堀内 圭輔（整形外科・総合医科学研究センター）
  • 毛の新たなる存在意義　－毛嚢は免疫スイッチ－
    永尾 圭介（皮膚科）
  • 心筋梗塞の傷跡をよくする白血球・悪くする白血球・調節する白血球
    安西 淳（循環器内科）
  • ビタミンEは骨を減らす？
    竹田 秀（腎臓・内分泌・代謝内科）